如何觀察單細胞在復(fù)雜信號系統(tǒng)中的應(yīng)答

 

       來自斯坦福大學(xué)的單分子研究專家Stephen Quake研究組在單分子實驗中也遇到了相同的問題，他們希望能檢測相同細胞對于相同信號的反應(yīng)，之前研究人員已經(jīng)利用定量PCR進行了批量分析，但是他們還是希望能就單個細胞如何對不同濃度的信號分子TNF-α產(chǎn)生相應(yīng)的響應(yīng)進行分析。

       細胞信號交流調(diào)控著基本的細胞活性以及人體中相應(yīng)的細胞活動。細胞準(zhǔn)確應(yīng)答周圍環(huán)境的能力是發(fā)育、組織修復(fù)和免疫的基礎(chǔ)。深入理解細胞間的相互交流將有助于了解生物系統(tǒng)的復(fù)雜性，或能開發(fā)出癌癥，糖尿病及其他自身免疫疾病的新療法。

       因此Quake研究組研發(fā)了一種新方法來觀察單一細胞在細胞信號復(fù)雜系統(tǒng)中的應(yīng)答反應(yīng)，這種方法就是高通量的微流體細胞培養(yǎng)（high-throughput microfluidic cell culture），將這一技術(shù)與熒光顯微鏡，定量基因表達分析和建立數(shù)學(xué)模型等研究手段結(jié)合起來，Quake研究組發(fā)現(xiàn)相同細胞之間存在大范圍的差異，并且指出了科學(xué)家的一些認識可能已經(jīng)被基于細胞群體研究的結(jié)果所誤導(dǎo)。

       細胞活化這一結(jié)果是一樣的，然而細胞達到結(jié)果的過程可能是不一樣的，群體研究不能顯示信息錯綜復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)中的差異，而這在單一細胞水平中可以觀察到。

       研究人員利用不同的蛋白濃縮物刺激細胞，這些濃縮物是免疫系統(tǒng)應(yīng)答炎癥或癌癥反應(yīng)的代表性物質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一些細胞接受信號并被激活，而一些細胞則沒有激活。研究人員人員觀察到細胞以不同的方式產(chǎn)生應(yīng)答，但是細胞的基本反應(yīng)在許多方面是一致的。

       這種方法的優(yōu)勢是效率十分高——利用這種方法，研究人員能同時處理成百上千的細胞，并且觀察長達4天的時間里，這些細胞的反應(yīng)。而缺點就是微流體實驗并不容易操作，因此一定要考慮清楚。如果你希望觀測細胞對于一個信號刺激的反應(yīng)，那么也許一個96孔板就能搞定，但是如果你希望了解細胞在系列環(huán)境中的反應(yīng)，那么微流體實驗也許更加合適，具體來說還得看個人的情況。

 

如何分析單細胞不同時間基因表達的細微差別?

 

       來自加州大學(xué)歐文分校H. Kumar Wickramasinghe教授研究組希望能驗證基因異常表達，會導(dǎo)致干細胞變成癌癥干細胞這一理論，因此需要分析單個細胞生命周期中不同時間點內(nèi)，基因表達的細微差別。

       在這項研究中，Wickramasinghe教授采用了一種新方法來處理mRNA，這種方法主要借助于一種十分精巧，稱為介電納米探針（dielectrophoretic nanoprobes，生物通譯）的探針，這種探針表面帶有特異性mRNA的引物。當(dāng)這種探針的針尖（20nm）通過細胞膜的時候，就會產(chǎn)生一個電場，吸引細胞核內(nèi)的分子，這樣探針收回來的時候，研究人員就能計算這一mRNA選擇性“釣”到的分子，比如在Wickramasinghe教授這一實驗中，就是癌基因表達相關(guān)的分子。

Wickramasinghe教授認為這種方法中細胞不會死亡，從而研究人員之后還能向其注入試劑，讓這一基因沉默，一個星期之后又能實時觀察細胞的具體變化了。

       這一方法的優(yōu)點就是相對于其它基因組分析方法，這一方法不會破壞細胞，能進行進一步分析，而且實驗過程時間短——整個過程大約只需要幾分鐘。缺點就在于這些細胞必需是自然貼壁的，如果像成纖維細胞那樣，就要增加一步步驟進行處理。不過Wickramasinghe教授提出也許可以在浸泡在一種細胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)物中對細胞進行處理。

如何提高檢測靈敏度

來自維吉尼亞州大學(xué)，伊利諾斯大學(xué)的研究人員在單細胞動力學(xué)研究方面就遇到了這種問題：細胞在移動過程（包括相互黏連，或者到細胞外基質(zhì)中去）中需要借助分子力前進或者后退，研究人員希望能分析單個細胞中的這種機械力。

維吉尼亞州大學(xué)的Martin Schwartz教授研究組為此發(fā)明了一種傳感器，這種生物傳感器能在活體中測量蛋白所承受力，研究人員利用這一傳感器發(fā)現(xiàn)了粘著斑蛋白承受力的奧秘。

       細胞對物理力量做出響應(yīng)的能力對于發(fā)育和生理來說都是根本性的，包括血液、細胞粘附和遷移的調(diào)控。難以對活體細胞中的分子力進行測量的難度限制了對此現(xiàn)象的研究。

       新開發(fā)的這種傳感器就是一種基因編碼的熒光張力感應(yīng)模塊，該模塊能夠在活體中測量穿過特定蛋白的機械力。研究人員利用這種傳感器對粘著斑蛋白進行了測試——粘著斑蛋白是一種膜-細胞骨架蛋白，它被吸引到粘著斑上，并將細胞粘附分子（整合素）與肌動蛋白細絲相連。結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)粘著斑蛋白承受力的能力決定粘著斑在力的作用下是整合還是分解。

       這種新型生物傳感器應(yīng)能應(yīng)用于力傳導(dǎo)中所涉及的其它蛋白，主要優(yōu)點就是能的分析涉及的機械力，而且靈敏度高，比一般方法的靈敏度至少高100倍，也能用于檢測細胞膜表面變形情況。缺點就是蛋白接觸傳感器會改變蛋白的功能，因此研究人員需要花費較多的時候嘗試。

如何簡單快捷觀測磷酸化蛋白

來自東京大學(xué)干細胞生物學(xué)與再生醫(yī)學(xué)研究室Hiromitsu Nakauchi教授希望能了解干細胞增殖和重編程過程中的分子級聯(lián)信號，因此他分析了造血干細胞中蛋白磷酸化造成的影響。

       在這項研究中，Nakauchi教授采用了一種簡單的免疫染色技術(shù)：單細胞磷酸成像分析（single-cell imaging of phosphorylation assay，SCIPhos）。首先將大約50個細胞想排列在載玻片上，然后進行染色，通過共聚焦顯微鏡進行觀察，通過這些染色了的磷酸化修飾蛋白，Nakauchi教授可以了解哪些蛋白處于活性狀態(tài)，哪些蛋白失活了，以及這些蛋白的位置。Nakauchi教授說，“我的一些學(xué)生也利用這個方法來做Western Blotting”。

       這種SCIPhos方法的優(yōu)點就是不僅僅能觀察磷酸化蛋白，而且能分析蛋白的位置，這有利于揭示關(guān)鍵的生物信息。缺點就是每個細胞需要單個成像，如果需要處理上千個細胞，那就是一個繁重的實驗了。因此這個方法比較合適分析少量的細胞，其中的小技巧就是要多注意防止水分蒸發(fā)，Nakauchi教授就是采用的在細胞液滴的周圍，用阻水筆（water-repellent pen）繞著畫一圈，這樣液滴就不會干燥得太快。

 

如何實時觀測RNA運動www.elisa17.com

     

       來自愛因斯坦醫(yī)學(xué)院的細胞生物學(xué)教授Robert Singer希望能了解mRNAs通過細胞核核孔中進入細胞質(zhì)的具體過程，但是傳統(tǒng)的顯微技術(shù)并不能實時追蹤到這個過程，因此Singer教授想出了一個新方法，觀察活細胞中RNA的運動情況。

       首先Singer教授用黃色熒光蛋白標(biāo)記mRNA分子，用紅色熒光蛋白標(biāo)記核孔，通過高速攝像機將mRNA分子通過核孔的過程拍攝下來，從而揭示了mRNA分子如何通過核孔從細胞核進入細胞質(zhì)的動態(tài)機制。這是研究人員*次在活細胞中實時觀察分子的膜孔轉(zhuǎn)運。這項研究也發(fā)現(xiàn)了與之前認知不同的結(jié)果：mRNA迅速地通過了核孔，緩慢地停泊在細胞核的邊緣等待釋放進入細胞質(zhì)，具體而言是單個mRNA分子在到達核孔后會等待80毫秒，然后在5毫秒的時間內(nèi)快速通過核孔，zui后分子在核孔的另一邊又等待80毫秒然后才被釋放到細胞質(zhì)。

       在此之前，顯微鏡的分辨率僅為200nm，這意味著活細胞中小于這一范圍的分子無法被分辨。而通過這項新技術(shù)，研究人員將顯微鏡的分辨率提高了10倍，成功地區(qū)分了大小僅為20nm的分子。

這一方法的優(yōu)點是測量精度提到了納米級，缺點是這種成像方法中用到的兩個相機拍攝必須*對齊，這并不是個簡單的工作。